Startpagina / Samenvattingen / Massaspectrometrie en Proteomics / cross-linker-xlms-peptide

Mass Spectrometry (MS)-Based Structural Biology - Cross-Linking MS

6 belangrijke vragen over Mass Spectrometry (MS)-Based Structural Biology - Cross-Linking MS

Welke drie aspecten van de structuur van een eiwit kun je achterhalen met XLMS?

1. Identificieren van interacterende partners
2. Lokeren van eiwit binding interfaces
3. Lage resolutie informatie van drie-dimensionele structuur verkrijgen

Hoe verloopt de workflow van XLMS?

Een crosslinking reactie wordt verkregen door het sample te incuberen met een cross-linker, de reactie wordt gestopt door de overmaat te verwijderen of een quenching reagent toe te voegen die reageert met de overige cross-linkers. Vervolgens wordt er een bottom-up analyse uitgevoerd.

Welke factoren zijn van invloed op het XLMS experiment en moeten worden geoptimaliseerd?

- Cross-linker chemistry & concentratie
- Incubatie temperatuur (vaak kamertemperatuur ) & tijd
- Buffer compositie & pH

Hoe verloopt de cross-linking reactie?

De cross-linker heeft meestal twee reactieve gropeen die reageert met een amine-, carboxyl- of thiolgroep. Vaak bevat de cross-linker twee N-hydroxysuccinimide esters die reageren met amines, vaak van lysines want die zijn abundant en aan het oppervlak blootgesteld. De lengte van de spacer arm van de cross-linker is ook belangrijk voor het aantal reacties. Vooraf kan de concentratie van de cross-linker worden bepaald met titratie zodat er geen onspecifieke fixatie plaatsvindt.

Hoe kan men ervoor zorgen dat de complexiteit wordt verminderd en het product wordt verrijkt bij een XLMS experiment?

Op eiwit level kan dit worden gedaan door size-exclusion chromatografie of met affiniteitchromatografie.

Op peptide level kan dit worden gedaan met peptide -SEC of IEX. Dit wordt gedaan met deze vormen van chromatografie omdat de meest informatieve type crosslinker (de intra- en intermoleculaire contacten) het grootst en meest geladen zijn. Ook kan er bij cross-linker gebruik worden gemaakt van een affiniteits tag, dus kan er ook AP worden gedaan.

Welk probleem loop je tegen aan bij data analyse bij XLMS en hoe kan dit worden opgelost?

Bij crosslinking wil de mogelijk stellen dan elk peptide met elk peptide kan binden, dus is n^2, wat het identificeren een stuk complexer maakt.

Dit kan makkelijker worden gemaakt door gebruik te maken van isotoop labeled crosslinkers en deze door het isotooppatroon te kunnen herkennen dus te identificeren. Een andere manier is door de corsslinker te labelen met een makkelijk te fragmenteren label. Hierdoor kan je deze herkennen in je MS2 spectrum en hierop selecteren en een MS3 uitvoeren en dus de n^2 naar n weer brengen.